PCR Nedir? PCR Optimizasyonu ve Temel Basamakları
Saflaştırılmış DNA polimerazları ve kimyasal olarak sentezlenmiş DNA oligonükleotidleri sayesinde özel olarak belirlenmiş bir DNA dizisinin hızlı ve yaşayan bir hücreye gerek kalmadan kopyalanması mümkündür. Bu tekniğe “polimeraz zincir reaksiyonu (polymerase chain reaction)” PCR denir. Bu teknik sayesinde genomun tamamı bilinmeden ve konak hücreye gerek kalmadan sadece istenilen DNA dizisinin bilinmesiyle, o DNA parçası in-vitro olarak milyarlarca kez kopyalanabilir.
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir in vitro ve in vivo DNA amplifikasyon metodudur, reaksiyonlar farklı sıcaklıklardaki üç olayın çevrimler halinde tekrarına dayanmaktadır. PCR ile DNA fragmentleri çoğaltılabilir ve çok küçük örneklerden analizler için yeterli miktarlar elde edilebilir.
Gerekli olan reaktifler:
1) kalıp olarak kullanılacak DNA (genomik DNA);
2) iki tane tek iplikli sentetik DNA oligonükleotidi (forward ve reverse primer), PCR yapılmak istenen gen dizisini belirler;
3) dört tip deoksiribonükleotid trifosfat (dNTPs);
4) yüksek ısıda çalışabilecek bir DNA polimeraz (Taq DNA pol.).
PCR temelde üç ana döngünün tekrarlarından meydana gelir:
• denatürasyon 94ºC’de çift iplikçikli DNA’nın iki tek iplikçiğe ayrılması;
• annealing (eşleşme) 50-60ºC’de primerlerin tek iplikçik halindeki kalıp DNA’ya spesifik olarak bağlanmaları;
• extension (sentez) 72ºC’de, primerlerle sınırlandırılmış olan bölgenin Taq pol. tarafından amplifikasyonu.
Deneturasyon ve extension fazlarındaki ısılar değişmezken annealing (eşleşme) ısısı istenen DNA dizisinin AT/GC içeriğine göre değişir. Döngüler yaklaşık 30 defa tekrar edilir. Yeni sentezlenen fragmentler bir sonraki döngüde kalıp görevi görürler böylelikle her döngüde çoğaltılmak istenen dizinin logaritmik (2n, n=30-35 döngü) bir artışı söz konusudur. PCR ile 150–3000 nükleotidlik diziler çoğaltılabilir.
PCR’da en iyi şekilde spesifik amlikon verimi elde etmek için üzerinde durulması gereken parametreler bağlanma sıcaklığı ve süresi, uzama sıcaklığı ve süresi ve döngü sayısıyla iniş çıkış sürelerinin az olmasıdır.
Bağlama sıcaklığı kullanılan primerlerin Tm sıcaklığına göre ayarlanır. Amplikonların uzunluğu arttıkça uzama süresi artar.
Kalıp DNA’nın çok olması PCR’ı engeller. Seyreltilmelidir.
Ayrıca kullandığımız kalıp DNA’ya göre özgün amplikon sayısını arttırmaya yönelik özel maddeleri de PCR tüplerine ekleyebiliriz. (DMSO, Betain, Formamid, BSA gibi.)
Kaynaklar:
1-Lodish, Berk- Moleculer Cell Biology, Fifth Edition
2-KOÜ Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, Öğrenci Laboratuarı -2, Kandan DNA izolasyonu ve elektroforezi kesimi haritalanması ve blotlanması
3-William s. Klug, R. Cummings, Genetik Kavramlar, 2009 | 