Enzim Aktivite Tayininde Kullanılan Yöntemler
Enzim aktivite tayininde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Aktivite tayinlerinde genellikle ya kaybolan substrat miktarı yada meydana gelen ürün miktarı tayin edilerek enzimlerin aktiviteleri ölçülür. Çoğunlukla hücredeki enzim proteinini tayin etmek çok zordur. Bunun yerine kaybolan substrat veya oluşan ürünü ölçerek enzim hakkında bir fikir sahibi olabiliriz. Enzim aktivite tayininde yöntem seçerken metodun pratik oluşuna ve kısa sürede yapılışına, ayrıca hassas oluşuna da özen göstermek gerekir. Aktivite tayininde kullanılan bazı terimleri ve ne anlama geldiğini inceleyelim:
Ünite: Bir mikromol substratı bir dakikada ve optimal koşullarda ürüne çeviren enzim miktarı bir ünite olarak kabul edilmektedir. Enzim üniteleri UI şeklinde gösterilmektedir.
Spesifik Aktivite: Bir miligram proteinde bulunan enzim ünite sayısı spesifik aktivite olarak kabul edilir. Spesifik aktivite ünite/mg protein olarak kabul edilmektedir. Buna göre spesifik aktiviteyi aşağıdaki gibi yazabiliriz;
...........................ünite
spesifik aktivite = -----------------------
........................miligram protein
Örneğin; 5 mg proteinde 750 ünite ölçmüşsek, bu enzimin spesifik aktivitesi 150 UI/ mg bulunur.
Enzim aktivite tayininde kullanılan yöntemleri yedi başlık altında toplayabiliriz.
• Spektrofotometrik yöntem,
• Monometrik yöntem,
• Thunberg yöntemi,
• Elektrot yöntemi,
• Polimerik yöntem,
• Kromatografik yöntem,
• Kimyasal tayin yöntemi.
Yukarıda kullanılan yöntemler aşağıda kısaca açıklanmışlardır.
Spektrofotometrik Yöntem
Pekçok enzim substratı, ürünü veya koenzimi, görülen ışıkta veya ultraviyole ışıkta bir tepe değeri göstererek, absorbans vermektedir. Bu takdirde ya substratın kaybolması yada ürünün meydana gelişi gibi koenzimdeki değişiklik spektrofotometreden tayin edilir. Spektrofotometrik yöntem kolaylığı, basitliği ve hassas oluşu nedeniyle diğer yöntemlere göre daha çok tercih edilmektedir. Bu yöntemde optik dansite değişimi, belirli miktardaki enzim ünitesini verir. Birçok enzimin aktivite tayini bu yöntem ile yapılmaktadır.
Monometrik Yöntem
Bir komponenti gaz olan enzimlerin aktivitesini ölçmek için kullanılan yöntemdir. Örneğin; oksidazlarla oksijen alınımı ve dekarboksilazlarla karbon dioksit salınımı bu yöntemle ölçülür.
Thunberg Yöntemi
Çok sayıda dehidrogenaz enziminin aktivitesi bu yöntem kullanılarak ölçülür. Metilen mavisi elektron akseptörüdür. Bu bileşiğin okside durumu renkli, redükte durumu ise renksizdir. Enzim aktivite tayin ortamına belirli miktarda metilen mavisi ilave edilir. Göz ile renk kaybolmasındaki geçen zaman saptanır. Deney havanın oksijeninden korunmak için özel bir tüpte yapılır. Bu özel tüpe "Thunberg tüpü" denir ve yöntemde adını bu tüpten almıştır.
Elektrot Yöntemi
Cam elektrotlarla oluşan ürünlerin ölçülmesi esasına dayanır.
Polimerik Yöntem
Pekçok enzimin substratı optikçe aktiftir. Eğer üründe optik aktivite değişmesi görülecek olursa bu yöntem kullanılmaktadır. Substratın aktif ve ürünün optikçe aktif olduğu durumlarda yine bu yöntem uygulanmaktadır. Eğer substrat ve ürünün ikiside optikçe inaktif ise, o zaman bu yöntemin kullanılması uygun değildir.
Kromatografik Yöntem
Diğer yöntemlerle bir ölçme yapılamadığında bu yönteme başvurulur. Enzim substrat karışımlarından belli zaman aralıklarında örnekler alınır. Kromatografik yöntemde, substrat ve ürün kromatografi kağıdına veya ince tabaka kromatografisiyle birbirinden ayırt edilir. Bazı hallerde radyoaktif substrat kullanıldığı için ayırımdan
sonra leke, ya ince tabaka kromatografisinde olduğu gibi kazınacak, yada kağıt kromatografisinde olduğu gibi kesilerek sayım şişelerine koyulacaktır. Radyoaktivite miktarı sayaçta sayılır ve tayini yapılır. Bazı enzim aktivitelerinde ürünün meydana getirdiği lekenin büyümesi ile enzim faaliyeti hakkında bilgi edinilir.
Kimyasal Tayin Yöntemi
Birçok enzim reaksiyon başladıktan sonra belirli zaman aralıklarında karışımdan örnek alıp, substrat ve ürünün kimyasal yöntem ile miktarı tayin edilir. FISKE ve SUBBAROW kolorimetrik yöntemi olarak inorganik fosfat tayinini gerçekleştirmiştir. Fosforilaz, fosfotaz, nükleotidaz enzimlerinin aktivite tayinleri aynı yolla yapılır. Pirofosfat (Ppi) bağı, bir normal HCl ve 100 derecede 10 dakika kaynatılmakla kırılmakta ve inorganik fosfat meydana gelmektedir. İnorganik fosfatın miktarı ise,kolorimetrik yöntem ile tayin edilmektedir. Bu yöntem ATP ve ADP'nin karıştığı bazı kinaz ve sentetaz reaksiyonlarında enzim aktivitesi bu yöntem ile tayin edilir.
Deneyler
Deney 1: Amilaz Aktivitesinin Tayini
Alfa ve beta amilazlar, her ikiside nişastanın ve glikojenin alfa-1,4 glikozit bağlarına etki ile onları maltoz ve dekstrinlere parçalarlar. Alfa amilazın sistematik adı 1,4- glukan-4-glukanohidrolaz olup molekül ağırlığı 45.000'dir. Alfa amilaz tükürük, insan pankreası ve Pseudomonas ve Aspergillus mikroorganizmalarından kristalleş- tirilmektedir. Amilaz enzimleri genel olarak üç grupta toplanır:
a. Alfa Amilaz (Endoamilaz): Çok yavaş olarak hidroliz olayına katılırlar. Hasta olarak adlandırılan bir seri üç veya daha fazla alfa-1,4 bağlı glikoz birimlerini taşıyan ürünler açığa çıkarırlar. Buna, özellikle klorür ve bazı iyonlar da aktivatör olarak etki eder. Alfa amilaz glikojenin dokularda yıkılmasında rol oynamaz, zira glikojen 1,4 glikozit bağının yıkılışı dokularda fosforilize olur. Glikojendeki 1,6 bağlarını da yine amilaz değil, ancak amilo 1,6 glikozidaz yıkar
b. Beta Amilaz (Egzoamilaz): Bunlar nişastanın amiloz kısmını maltoza kadar hızlı bir şekilde hidroliz ederler. Polisakkaritte alfa-1,4 glikon bağlarını hidroliz ederek zincirlerin redükte olmayan uçlarında maltoz birimlerini ayırırlar. Bitkisel bir enzimdir ve özellikle bira, malt ekstrelerinde bulunur.
c. Gama Amilazlar: Kısa bir süre önce bağırsak ve karaciğerde ortaya çıkan, nişastayı maltoz birimlerine değil glikoz birimlerine kadar parçalamaktadır.
Enzim 1,4 ve 1,6 bağlarını hidrolizleyip nişasta ve glikojeni tamamen parçalayabilir.
Tüm bu amilaz enzimlerinin etkisiyle oluşan ürünler, çözülebilen nişasta ve maltozdur. Nişasta beta amilaz ile parçalandığı sırada, serbest asetal hidroksili beta durumunda bulunan beta maltozları oluşturduğu halde, alfa amilazla parçalanmasında alfa maltozlar açığa çıkar. İşte amilazların alfa ve beta adı bu neticeden gelmektedir.
Tükürük %99.5 su içerir. Ayrıca tükrük amilazı yani pityalin ve birkaç protein (musin bir glikoproteindir), inorganik iyonlar (kalsiyum, potasyum, sodyum ve klorür) ve fosfatları taşır. Bunlardan başka aminoasitler, üre, ürik asit ve kolesterol gibi biyoorganik bileşiklerde tükürükte bulunurlar. Bunların hepsi amilaz enziminin yapısına girmektedir.
Araç ve Gereçler:İnsan tükürüğü ve dana salyası, %1 w/v nişasta çözeltisi, %1 w/v (tuz) NaCl, sulu iyot çözeltisi, fosfat tamponu, su banyosu (38 derecede), pipetler (1 mililitrelik ve 5 mililitrelik), dereceli silindir (100 mililitrelik), beher (50 mililitrelik), test tüpü (18x150 mm ve 30 adet), pastör pipeti.
Uygulama: Toplanan insan tükürüğünün bir mililitresi 100 mililitrelik dereceli silindire pipetlenir. 100 mililitre işaretine kadar sulandırılır ve iyice karıştırılır. Bir test tüpüne 5 mililitre %1'lik nişasta çözeltisi konulur. Üzerine 2 mililitre %1 NaCl ve 2 mililitre fosfat tamponu ilave edilir. İyice karıştırıldıktan sonra 38°C sıcaklıktaki su banyosuna yerleştirilir.
Birer mililitre açık sarı iyot çözeltisi taşıyan 10 adet test tüpü hazırlanır. Sulandırılmış tükrüğün 1 mililitresi nişastalı deney karışımına konulur ve zaman kaydedilir.
Birer dakika arayla inkübasyon karışımından pastör pipeti ile iki damla alarak iyot çözeltisi bulunan tüplerden birine konulur. İyot çözeltisinde renk değişimi olduğu zaman (akromik nokta) geçen süre kaydedilir ve deneye son verilir (eğer geçen süre 5 dakikadan az veya 20 dakikadan çok ise, tükürüğün değişik sulandırımı kullanılarak 10 dakika civarında bir uç nokta bulunmalıdır). Deney insan tükürüğü yerine dana salyası kullanılarak tekrar yapılabilir. Amilaz Aktivitesinin Hesaplanması
Bir amilaz üniti; yöntemde tarif edilen deney koşullarında, 10 dakikada %1'lik ni- şastanın 5 ml'sini hidroliz eden amilaz miktarı olarak tarif edilir.
Amilaz Ünitesi = 100 (sulandırım faktörü) x 10/T (dakika)
T = Nişastanın ortamdan kayboluşu için geçen zaman.
Eğer nişasta değişik şekilde sulandırılırsa, sulandırma faktörü de ona göre değişir.
Çalışmada değişik sulandırma kullanılmadığı için, böyle bir değişiklik yapılmasına gerek kalmamıştır. Tüplerde renk değişiminin olduğu, berraklığın ortadan kalktığı nokta "akromik nokta" adını alır. Bu nokta nişastanın tümünün amilazla şekere dönüştüğü safhadır.
Çalışmada, amilaz enzim aktivitesinin ölçülmesinde insan tükrüğü ile dana salyasında aktiviteler ölçülerek, karşılaştırılması yapılır. Enzim aktivitesinin değerlendirilmesi fotoğraflarla belirlenerek, akromik nokta saptanır (Şekil 3.1, 2, 3, 4).
İnsan tükürüğü için: (Akromik nokta = 3. tüpte, 3. dakika)
Amilaz Ünitesi = 100 x 10/T
= 100 x 10/3
= 333,3 ünit
Dana salyası için: (Akromik nokta = 2. tüpte, 2. dakika)
Amilaz Ünitesi = 100 x 10/T
= 100 x 10/2
= 500 ünit
Amilaz, nişasta ve glikojene etkili bir enzimdir. Pankreatik sekresyonun nişasta parçalayıcı etkisi, pankreatik alfa amilaza bağlıdır. Nişasta ve glikojeni maltoz, maltotroz alfa-1,4 bağları ile bağlı 3 adet alfa-glikoz kalıntısı ve dallı 1,6 oligosakkaritler ve bir miktar glikoza parçalayıcı etkisi tükürük amilazınınkine benzemektedir.
Yapılan çalışmada analiz materyali olarak, insan tükürüğü ile dana salyası kullanılmıştır. Kullanılan dana salyasında mukus oranının fazla olması ve saf dana salyasının elde edilmesinin zor olması nedeniyle, amilaz enzim aktivitesi kesin olarak saptanamayıp yaklaşık bir değer elde edilmiştir.
İnsan tükürüğündeki amilaz düzeyi, dana salyasına göre daha fazladır ve daha çabuk parçalanmanın gerçekleşmesi gerekir. En azından reaksiyonun gerçekleşmesi için aralarında 30 dakika gibi bir zaman sürecinin geçmesi beklenir. Halbuki bulunan değer sadece bir dakikalık farktır. Bu yüzden sadece renk değişimine göre de-
ğerlendirme yapabiliriz. Amilaz miktarı hakkında kesin bir karşılaştırma yapamayız.
Deney 2. Katalaz Aktivesinin Tayini ve Kimyasal Katalizör Manganez Dioksitle Karşılaştırılması
Bu çalışmalarda katalaz denilen bir enzimin deney tüpünde basit kimyasal reaksiyonu hızlandırdığını görecek ve aynı reaksiyonu çabuklaştıran inorganik bir katalizörü, katalazla karşılaştırma fırsatı bulacaksınız.
Aktif kimyasal bir madde olan hidrojen peroksit, hücrede meydana gelen kimyasal reaksiyonlardan aralıksız olarak oluşan bir yan üründür. Hidrojen peroksit zehirlidir; eğer derhal atılmaz veya parçalanmazsa, hücrelere zarar verir. Bir katalizör bulunduğu zaman, hidrojen peroksit oksijen ve suya ayrılarak zararsız hale gelir.
Araç ve Gereçler : karaciğer, patates, havuç, kuru soğan v.b. bitkisel ve hayvansal dokuları, %3 hidrojen peroksit çözeltisi, manganez dioksit (toz), bitkisel ve hayvansal dokular, ince kum, küçük deney tüpleri, tüplük, pens, bunzen beki, havan.
Uygulama: İki deney tüpü alarak her ikisine de 2 ml kadar hidrojen peroksit çözeltisinden koyunuz. Tüplerden birine az miktarda (0.1 gr) ince kum atınız. Eğer bir sonuç elde ederseniz kaydediniz. İkinci tüpe aynı miktarda manganez dioksit katınız. Ne olduğunu gözleyiniz ve kaydediniz. Yanmakta olan küçük bir tahta parçasını tüpün ağzına tutunuz.
Diğer bir deney tüpüne 2 ml kadar hidrojen peroksit çözeltisinden koyunuz. Pensle küçük bir karaciğer parçası alarak hidrojen peroksit tüpüne atınız. Bir kaç dakika gözleyiniz ve sonucu yazınız.
Şimdi bir önceki deneyde kullandığınız büyüklükte bir karaciğer parçasını bir havana koyarak dövünüz. Bunu taze hidrojen peroksit ihtiva eden bir deney tüpüne koyunuz. Dövülmüş karaciğerin faaliyetini, daha önce gözlediğiniz parça karaciğerin faaliyeti ile karşılaştırınız.
Şimdi diğer bir karaciğer parçası alarak bir kaç dakika kaynar suda tutunuz. Bundan sonra kaynamış karaciğeri hidrojen peroksite koyunuz ve karaciğer enziminin hidrojen peroksiti parçalayıp parçalamadığını gözleyiniz. Bu deneyleri diğer canlı dokularla tekrarlayınız. Her materyalin faaliyetini şekilde gördüğünüz gibi basit bir tablo haline getiriniz. Reaksiyonların hızlarını gösteren bir cetvel yapınız.
Yazarlar
Prof.Dr. Ahmet ÖZATA
Yrd.Doç.Dr. Cengiz TÜRE | 